<div dir="ltr">Dear All,<div><br></div><div>I am a neurobiologist/cell biologist at Institute of Biochemistry, Charite Medical University, Berlin.</div><div><br></div><div>I am trying to study the interaction between 2 proteins (donor GFP-tagged protein present in nucleus and cytoplasm whereas acceptor mCherry-tagged protein present only in the nucleus) using FLIM-FRET and am naive to the detailed analysis of my samples using FLIMfit.</div><div><br></div><div>We are using the Leica SP5 confocal system with Picoharp300 (Picoquant) at 80 MHz for acquiring our data and using FLIMfit to analyze our images.</div><div><br></div><div>I am going through the following steps to work on the data (sample image):</div><div>1. I assess the decay at a given pixel and import pre-defined IRF from SymphoTime64.</div><div><br></div><div><img src="cid:ii_15af2073e4b15555" alt="Inline image 2" width="544" height="340"><br></div><div><br></div><div>2. As the pixel number is low, I use 5x5 or 7x7 smoothing (7x7 in this example). <span style="font-size:12.8px"> </span><span style="font-size:12.8px">After that I select segments in the cell (nucleus and cytoplasm respectively) and perform a mono-exponential fitting, which gives me this:</span></div><div><span style="font-size:12.8px"><img src="cid:ii_15af2144afe68c15" alt="Inline image 3" width="544" height="340"><br></span></div><div><span style="font-size:12.8px"><br></span></div><div><span style="font-size:12.8px">3. Since I have FRET data, I perform a bi-exponential fit and use the Global fitting approach which gives me this:</span></div><div><span style="font-size:12.8px"><img src="cid:ii_15af2166579fe529" alt="Inline image 4" width="544" height="340"><br></span></div><div><span style="font-size:12.8px"><br></span></div><div><span style="font-size:12.8px">4. </span><span style="font-size:12.8px">When I look at the parameters of selected segments, I get the following info:</span></div><div><span style="font-size:12.8px"><br></span></div><div><span style="font-size:12.8px"><img src="cid:ii_15af21905ea8ee45" alt="Inline image 6" width="544" height="340"><br></span></div><div><span style="font-size:12.8px"><br></span></div><div><div style="font-size:12.8px">1- Cell 1/cytoplasm</div><div style="font-size:12.8px">2- Cell 1/nucleus</div><div style="font-size:12.8px">3- Cell 2/nucleus</div><div style="font-size:12.8px">4- Cell 2/cytoplasm</div></div><div style="font-size:12.8px"><br></div><div style="font-size:12.8px"><div style="font-size:12.8px">I had the following questions concerning my analysis:</div><div style="font-size:12.8px">1. I wanted to confirm whether the tau_2 values I get are the donor lifetime values for the given segments (2.35 ns in cytoplasm vs 2.22/2.20 ns in nucleus)? Because I expect FRET only in the nucleus, I would see a decrease in the lifetime values only for the nucleus as compared to the cytoplasm from the same cell (which would serve as my internal control).</div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px"><br></span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">2.  I don't quite understand the high tau_1 values that I observe. What could be the explanation for that?</span><br></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px"><br></span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">3.Can I rely on the values presented above? I am concerned about the IRF as it is predetermined value that I am using. </span><span style="font-size:12.8px">As suggested by Ewan McGhee in response to </span><span style="font-size:12.8px">Marko Šoštar's query, I can try to use FITC to measure IRF of our setup.</span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px"><br></span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">4. Is there anything I can make my data acquisition or analysis more robust?</span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px"><br></span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">I would really appreciate any feedback on this.</span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px"><br></span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">Thank you very much.</span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px"><br></span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">Regards,</span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px"><br></span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">Mayur Vadhvani</span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">Postdoctoral Researcher</span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">Institute of Biochemistry</span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">Charite Medical University</span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">Berlin</span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">Germany</span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px"><br></span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">PS: </span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">Dear Marko, </span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px">I am also including you in the email as I am also using the Leica/PicoQuant system for my image acquisition.</span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px"><br></span></div><div style="font-size:12.8px"><span style="font-size:12.8px"><br></span></div></div></div>