<div dir="ltr"><div><div>Hi,<br></div>my name is Marko and I am a phd student on
 the Institute Ruđer Bošković in Zagreb, Croatia. <br>I recently did some FLIM-FRET measurements where I tried 
to find out FRET-ing population in a sample by fitting on the 
double-exponential model N(t) = A1*exp(−t/t FRET) + A2*exp(−t/t 0). 
Ideally, I would measure donor lifetime (t0) from donor only sample 
(mono-exponential decay), and then use this as a fixed parameter in 
subsequent fitting procedures (with acceptor present). And, that worked 
fine until recently, when I came across a sample where very small change
 in donor lifetime (fixed parameter-I was playing with manually changing
 it) would yield substantial difference in fitted A1 and A2, with 
equally good fit quality (chi-squared test). So, now I can't decide 
which amplitudes to use. Does anybody have some advice how to resolve 
this issue?<br>We use Leica confocal microscope paired with PicoQuant 
TCSPC system and SyphoTime software for analysis. I should mention that I
 never measured IRF (software offers to approximate it), so I'm not sure
 how this affects fitting results. Also, I recently became aware of the 
FLIM fit software, and I was wondering is there anyone experienced with both SymphoTime and FLIM fit. What would be the better choice? Could this fitting issue be resolved by using FLIM Fit (maybe it has some extra features 
for assessing goodness of fit?)? Also, could you tell me what would be 
the best sample (way) for measuring the IRF function (gold nanorods?- 
where to get them?).<br></div><div>I would greatly appreciate any advice.<br><br></div><div>Thank you and kind regards,<br></div>Marko Šoštar</div>